Analisi strutturale e funzionale di ferroportina e ceruloplasmina umana prodotte dal lievito Pichia pastoris

Gruppo di lavoro

• Dott. Antimo Cutone (Università degli Studi del Molise);
• Dott.ssa Giusi Ianiro (Università degli Studi del Molise);
• Prof.ssa Maria Carmela Bonaccorsi di Patti (Università ‘La Sapienza’ di Roma);
• Prof. Fabio Polticelli (Università Roma Tre).

Descrizione

La ricerca è rivolta allo studio strutturale e funzionale di proteine coinvolte nella gestione del ferro negli eucarioti, con particolare attenzione alle ossidasi blu multinucleari a rame e alle permeasi. Le ossidasi blu multinucleari a rame sono enzimi in grado di accoppiare l’ossidazione monoelettronica dei substrati alla completa riduzione dell’ossigeno molecolare ad acqua. Questa attività è resa possibile dalla capacità di legare più atomi di rame in siti con differenti proprietà strutturali e funzionali. All’interno di questa famiglia di proteine, la ferrossidasi ceruloplasmina (Cp) dei mammiferi svolge un ruolo fondamentale nella corretta omeostasi cellulare del ferro collaborando con la permeasi specifica per il ferro, la ferroportina (Fpn). Fpn è l’unico esportatore di ferro cellulare noto nei mammiferi, appartiene alla Major Facilitator Superfamily (MFS), proteine che traslocano i loro substrati attraverso la membrana mediante un meccanismo di accesso alternato, ciclando tra conformazioni aperte verso l’interno e verso l’esterno. L’importanza della connessione ferrossidasi-permeasi è evidenziata dalla scoperta che mutazioni in ciascuna delle due proteine causano sovraccarico di ferro organo-specifico e neurodegenerazione. Tuttavia, le strutture della maggior parte dei membri MFS, come pure le interazioni strutturali e/o funzionali con le ferrossidasi, devono ancora essere risolte. La mancanza di tali informazioni impedisce la nostra comprensione dettagliata, e quindi il targeting farmacologico, di questi trasportatori.

Per tale motivo, la produzione di Fpn e Cp in forma ricombinante, come pure l’utilizzo di software bioinformatici, potranno risultare utili per analizzare le possibili interazioni strutturali, i meccanismi funzionali e le dinamiche molecolari alla base di tale sistema di esporto del ferro. A tal fine, il lievito Pichia pastoris è stato scelto come organismo modello per l’espressione delle due proteine nelle forme wild-type e mutanti. Inoltre, per indagare le modifiche conformazionali di Fpn che sono intimamente legate al meccanismo di esporto del ferro è stato messo a punto un sistema per l’incorporazione genetica della dansil-alanina, un amminoacido non naturale fluorescente, utilizzando la non-sense suppression technology.

Impatto

I risultati in silico, eseguiti mediante simulazioni di dinamica molecolare sulla struttura cristallina di un omologo della Fpn umana, corroborano l’esistenza di un meccanismo di accesso alternato già descritto per altri membri di MFS ed evidenziano come la riorganizzazione dei ponti salini sembra essere un evento molecolare chiave per il cambiamento conformazionale del trasportatore. Inoltre, i risultati ottenuti attraverso il sistema di ‘non-sense suppression technology’, progettato per l’incorporazione della dansil-alanina in quattro specifiche posizione amminoacidiche di Fpn, indicano che la dansil-alanina viene incorporata nella Fpn ricombinante e analisi di spettroscopia di fluorescenza suggeriscono che la sonda si trovi in ambienti diversi. Il lavoro proseguirà valutando eventuali cambiamenti conformazionali in presenza di ferro ed epcidina. Infine, è stata prodotta una forma ricombinante di Cp umana altamente pura e biologicamente attiva mediante l’utilizzo di un ceppo di lievito glicoingegnerizzato. Tuttavia, sarà necessario migliorare la resa proteica per valutarne il possibile uso terapeutico in pazienti aceruloplasminemici.

Pubblicazioni